论文题目：Protocol for elucidating metabolite binding and regulation of TET2 dioxygenase

期刊名称：STAR Protocols

成果所有人：叶丹课题组

论文发表时间：2025年09月19日

致谢平台或仪器：未提供

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基于代谢物筛选与验证的TET2活性调控机制研究总结 本课题的核心目标是建立一套标准化、可重复的实验流程，以系统性地筛选、鉴定并验证能够调控DNA去甲基化酶TET2活性的内源性及外源性小分子代谢物。研究聚焦于揭示代谢物与TET2相互作用的分子机制，并探索其在病理生理过程中的功能。以下从研究对象、技术平台与仪器、核心研究成果三个方面进行详细总结。一、 研究对象：TET2作为代谢-表观遗传调控的关键节点 本研究以人类TET2催化结构域为核心研究对象。TET2是一种α-酮戊二酸依赖的双加氧酶，负责催化DNA上5-甲基胞嘧啶的氧化去甲基化，是连接细胞代谢状态与表观遗传调控的关键分子。基于其已知的晶体结构和明确的代谢依赖性，本研究旨在通过高通量手段，发现并验证能够精确“微调”其酶活性的新型代谢物，从而理解其在感染、免疫及肿瘤等复杂生物学过程中的调控作用。二、 核心技术平台与仪器 为实现上述目标，研究构建并优化了一个集成化、多层次的技术平台，涵盖了从蛋白制备、活性筛选到分子互作验证的全流程。1. 重组蛋白表达与纯化平台： · 方法与仪器：采用原核表达系统，将带SUMO-His双标签的TET2催化域在BL21(DE3)大肠杆菌中诱导表达。利用高压均质机进行细胞破碎，通过Ni-NTA亲和层析进行初始富集，并使用ULP1蛋白酶切除标签以获得高纯度、无标签的活性蛋白。为进一步提高纯度，采用ÄKTA蛋白纯化系统配备的MonoQ 5/5强阴离子交换柱进行精细纯化。蛋白浓度通过SDS-PAGE电泳结合考马斯亮蓝染色，并与BSA标准品比对进行定量。2. 体外酶活性高通量筛选与定量平台： · 方法与仪器：本研究创新性地建立了一套基于流式细胞术的TET2活性检测方法。该体系以生物素标记的5mC-DNA为底物，TET2催化反应生成5hmC后，使用链霉亲和素磁珠富集DNA，再通过特异性5hmC抗体和Alexa Fluor 488标记的二抗进行荧光标记。最终，使用流式细胞仪检测荧光信号强度，该信号与5hmC产量呈线性相关，从而实现对TET2活性的快速、定量分析。该方法用于大规模筛选候选代谢物，并计算抑制剂的IC50值（如乙醛酸的IC50为220.4 µM），数据分析主要依靠GraphPad Prism软件。3. 代谢物-蛋白互作直接验证平台： · 方法与仪器：采用饱和转移差核磁共振技术，在原子水平直接验证代谢物与TET2蛋白的结合。实验在Bruker Avance III 600 MHz核磁共振波谱仪（配备5 mm三重共振低温探头）上进行。蛋白样品经过10 kDa超滤离心管进行多次缓冲液置换，转入氘代PBS缓冲液。使用标准脉冲序列，通过选择性饱和蛋白信号并观察小分子信号的衰减（STD效应），来判定结合事件。数据的采集和处理使用Bruker Topspin和MestReNova软件。该技术不仅证实了结合，还能通过竞争实验（如加入过量α-KG）确定结合位点。三、 核心研究成果 通过上述系统性研究，本课题取得了以下关键成果： 1. 成功建立并发表了一套标准化、可操作的实验方案：研究将完整的TET2蛋白纯化、流式细胞术酶活检测及STD-NMR结合验证流程，系统性地整理并发表于《STAR Protocols》期刊。该方案具有普适性，为领域内研究代谢物与表观遗传酶的相互作用提供了可靠的方法学框架和详细的技术细节（包括关键步骤的排错指南）。2. 验证了已知调控网络并发现了全新抑制剂：利用该平台，首先成功复现并验证了全部7个已知的TET2调控代谢物，包括激活剂（α-KG、维生素C）和抑制剂（琥珀酸、富马酸、D/L-2-羟戊二酸等），证明了筛选体系的可靠性与高效性。更重要的是，研究首次发现乙醛酸是一种新型的TET2竞争性抑制剂。3. 在分子机制层面阐明了乙醛酸的作用方式： · 直接结合验证：STD-NMR实验明确显示乙醛酸能直接与TET2蛋白结合，而阴性对照葡萄糖则不能。· 竞争性抑制机制：进一步的竞争性STD-NMR实验表明，过量的α-KG可以完全阻断乙醛酸与TET2的结合。同时，体外酶活实验证明，提高α-KG浓度能以剂量依赖的方式逆转乙醛酸对TET2活性的抑制。这两项证据强有力地表明，乙醛酸通过竞争α-KG的结合位点来抑制TET2的活性。· 定量药理学参数：通过流式细胞术检测，精确测定了乙醛酸抑制TET2的IC50值为220.4 µM，为其生物学功能的后续研究提供了关键定量依据。4. 奠定了转化研究的坚实基础：该研究所建立的方法和发现的乙醛酸-TET2互作机制，直接服务于更广阔的生物学问题。正如您之前总结的，后续研究利用此基础，成功揭示了在病原菌感染过程中，细菌源性的乙醛酸通过抑制巨噬细胞TET2、重塑宿主免疫应答、促进持留菌形成的完整病理机制，并提出了靶向该通路的治疗新策略。结论：本课题不仅成功构建了一个从分子到功能的多维度研究平台，更凭借该平台做出了原创性发现，将乙醛酸定义为一个全新的表观遗传调控信号分子。这项工作在方法学上具有创新性和推广价值，在科学发现上揭示了代谢物调控宿主免疫应答的新机制，为后续的基础与转化研究奠定了坚实的方法和理论基础。